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液相色譜分析理論
2012-07-18 [3671]

液相色譜法
液相色譜法
  液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品,由流動(dòng)相帶入柱內(nèi),在柱內(nèi)各成分被分離后,依次進(jìn)入檢測(cè)器,色譜信號(hào)由記錄儀或積分儀記錄。
1.對(duì)儀器的一般要求
  所用的儀器為液相色譜儀。色譜柱的填料和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠zui為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用;離子交換填料,用于離子交換色譜;凝膠或玻璃微球等,用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外,柱溫為室溫,檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。 在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí),所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法(附錄Ⅳ A)項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。 正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外,其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等,均可適當(dāng)改變, 以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。
2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
  按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn),即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整,應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求;或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的zui小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.
(1) 色譜柱的理論板數(shù)(n) 在選定的條件下,注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t<[R]>(以分鐘或長(zhǎng)度計(jì),下同,但應(yīng)取相同單位)和半高峰寬(W<[h/2]> ),按n=5.54(t<[R]>/W<[h/2]>)<2>計(jì)算色譜柱的理論板數(shù),如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的zui小理論板數(shù),應(yīng)改變色譜柱的某些條件(如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等),使理論板數(shù)達(dá)到要求。 (2) 分離度 定量分析時(shí),為便于準(zhǔn)確測(cè)量,要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為: 2(t<[R2]>-t<[R1]>) R= ──W<[1]>+W<[2]> 式中 t<[R2]>為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間; t<[R1]>為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間; W<[1]>及W<[2]>為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規(guī)定外,分離度應(yīng)大于1.5。
(3) 拖尾因子 為保證測(cè)量精度,特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí),應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定,或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為: W<[0.05h]> T=────── 2d<[1]> 式中 W<[0.05h]>為0.05峰高處的峰寬; d<[1]>為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外,T應(yīng)在0.95~1.05間。 也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下,配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液,加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液,配成三種不同濃度的溶液,分別注樣3次,計(jì)算平均校正因子,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。
3.測(cè)定法
定量測(cè)定時(shí),可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雜質(zhì)總量時(shí),須采用峰面積法。
(1) 面積歸一化法 測(cè)定供試品(或經(jīng)衍生化處理的供試品)中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和,并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜圖的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定,除另有規(guī)定外,可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。
(2) 主成分自身對(duì)照法 當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí),采用主成分自身對(duì)照法。在測(cè)定前,先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度,將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對(duì)照溶液,進(jìn)樣,調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度或進(jìn)樣量,使對(duì)照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測(cè)量要求。然后取供試品溶液,進(jìn)樣,記錄時(shí)間,除另有規(guī)定外,應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測(cè)得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對(duì)照溶液主成分的峰面積比較,計(jì)算雜質(zhì)限度。
(3) 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定供試品中雜質(zhì)的總量限度 采用不加校正因子的峰面積法。取供試品,按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖I;再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,在同樣的條件下注樣,記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外,應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù),色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上,否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測(cè)器靈敏度。 如果色譜圖Ⅰ中沒(méi)有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰,則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積(溶劑峰不計(jì)在內(nèi))。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰,應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積,即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積;色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積,即為各雜質(zhì)峰的校正總面積,各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。
(4) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱(量)取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì),分別配成溶液,精密量取各溶液,配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液,取一定量注入儀器,記錄色譜圖,測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計(jì)算校正因子: A<[s]>/m<[s]> 校正因子(f)=─ A<[r]>/m<[r]> 式中 A<[s]>為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高; A<[r]>為對(duì)照品的峰面積或峰高; m<[s]>為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量; m<[r]>為加入對(duì)照品的量。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖,測(cè)量供試品(或其雜質(zhì))峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計(jì)算含量: A<[x]> 含量(m<[x]>)=f×──A<[s]>/m<[s]> 式中 A<[x]>為供試品(或其雜質(zhì))峰面積或峰高; m<[x]>為供試品(或其雜質(zhì))的量; f、A<[s]>和m<[s]>的意義同上。 當(dāng)配制校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí),則配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱(量)取。
(5) 外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精密稱(量)取對(duì)照品和供試品,配制成溶液,分別精密取一定量,注入儀器,記錄色譜圖,測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積(或峰高),按下式計(jì)算含量: A<[x]> 含量(m<[x]>)=m<[r]>×── A<[r]> 式中各符號(hào)意義同上 由于微量注射器不易控制進(jìn)樣量,當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí),以定量環(huán)進(jìn)樣為好。

 

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